基因工程总结教学总结

基因工程总结教学总结

2020-11-14 00:03:34 浏览次数: 关键词:

基因工程

第一章绪论

1、 基因工程的含义:

按照人们的意愿,进行严密的设计,通过体外 DNA重组和转基因等技术,有目的地改造生物种性,使现有的物种

在较短时间内趋于完善,创造出更符合人们需求的新的生物类型。

2、 基因工程的优点:

打破物种间基因交流的隔离界限;②克服常规育种的周期长,效率低的缺点,定向改造生物性状;③可按照人的

意愿去改造物种。

3、 基因工程理论依据:

不同基因具有相同的物质基础;②基因是可分割的;③基因是可以转移的;④多肽与基因之间存在对应关系;⑤

遗传密码是通用的;⑥基因可以通过复制传递给下一代。

注:基因工程及其应用的图解看看

第二章DNA重组的相关技术及原理

1、 重组DNA技术的原理

重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,

使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的 DNA体外操作程序

2、 碱性SDS法提取质粒DNA

原理:强碱使所有DNA变性沉淀,而pH为中性时,质粒 DNA复性快,形成闭合环状从沉淀物中分离。

3、 提取DNA总的原则

保证核酸一级结构的完整性;

其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度;

核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;

其他核酸分子,如 RNA也应尽量去除。

4、 核酸鉴定

浓度鉴定 ②纯度鉴定 ③完整性鉴定

5、 限制性核酸内切酶 :是一类能够识别双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp),并使每条链的一个磷酸

二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。

6、 限制性内切酶的命名

用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 3个字母的略语表示寄主菌的物种名。

大肠杆菌 (Escherichia coli )Eco

流感嗜血菌(Haemophilus in flue nzae ) Hin

用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如 Ecok, Eco r (现在都写成平行,如 EcoR)。

如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制性内切酶,用罗马字母表示。如 EcoRI,EccRV。

属名 种名 株名

Haemophilus in flue nzae D 嗜血流感杆菌 D 株 Hi nd III

EcoRI — Escherichia coli RI

Hind in— Haemophilus in flue nsae d 川

Sad (II) — Streptomyces achromagenes I ( n )

7、 限制性核酸内切酶的作用机制

以环状和线形的双链 DNA为底物,在适合的反应条件下,识别一定的核苷酸序列,使两条核糖链上特定位置的磷酸

二酯键断开,产生具有 3' - 0H基团和5'— P基团的片段。

&同裂酶:能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶

完全同裂酶:识别位点和切点完全相同。 如Hi nd n和Hsu I。

不完全同裂酶:识别位点相同,但切点不同。 如Xma和Sma。

9、 同尾酶:识别的序列不同,但能切出相同的粘性末端。女口 BanHI、Bgl n、Bcl I、Xhon等

10、 酶活性单位(U):在最适反应条件下,一个 DNA分子上含有一个酶切位点, 60 min内切割1 g入DNA所需的

酶量称为一个单位。

11、 星号(*)活性:如果改变反应条件就会影响酶的识别位点专一性和切割效率,称为星号( * )活性。

12、 基因工程的其他酶

(1) DNA连接酶:DNA连接酶能催化双链 DNA切口处的5'-磷酸和3'-羟基生成磷酸二酯键。;

(2) DNA聚合酶 (Klenow fragment )

性质 ①5' 3'聚合酶活性。②3' 5'外切酶活性。(失去了 5' 3'外切酶活性)

用途①3'端补平②DNA的3'末端标记,在3'隐蔽端加上标记的 dNTP ③cDNA第二链的合成 ④双脱氧 末端终止法测定DNA序列

(3) 核酸酶S1

催化反应类型:ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区

13、 聚合酶链式反应 PCR : PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因 的技术。

加入4种物质:

(1) 作为模板的DNA序列;

(2) 与被分离的目的基因两条链 各自5'端序列相互补的 DNA引物(20个左右碱基的短 DNA单链);

(3) TaqDNA聚合酶;

(4) dNTP( dATP, dTTP, dGTP 禾口 dCTP。

14、 PCR技术的原理

(1)DNA模板变性(2)DNA模板与引物复性(3)DNA链的延伸

15、 PCR的过程

第一步 预变性(pre-denature ) 90-95 °C下5分钟,模板DNA双链完全变性成单链。

第二步 变性(denature )双链完全变性成单链

第三步 复性(anneal)37-60 °C下1分钟,引物优先与模板复性。 ① 引物的浓度高② 引物的链短。

第四步 延伸(extend) 72 °C下1-2分钟,Taq DNA聚合酶在引物的3 '端上加上核苷酸。

第五步 变性进入循环重复 94 °C下1分钟,新合成的 DNA双链又变性成单链模板。

16、 PCR扩增特异性DNA片段的主要条件

(1)Taq DNA聚合酶 (2)引物(primer) (4)模板(template) (5)dNTPs

(6) Mg 的浓度

17、PCR的特点

(5 )可以扩增mRNADNA通过凝胶分子筛向正极端移动(1)特异性强 (2)敏感性高 (

(5 )可以扩增mRNA

DNA通过凝胶分子筛向正极端移动

18、 电泳的基本原理

DNA在中性或偏碱性的缓冲液中带负电,在电泳过程中处于凝胶靠负极端的

19、 电泳迁移率:

与DNA分子的构型和大小有关 与DNA分子中的碱基组成和顺序无关

DNA分子的构象(型):1型:超螺旋环状 H型:带切口环状 川型:线状

相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快; 线性分子次之;伸展开环状最慢

20、影响连接反应的因素

(1) 插入片段与载体的浓度比例 (10~20倍 增加插入片段与载体的接触机会,减少载体自我连接的现象。 )

(2) 反应温度 (一般14~16C )

(3) 反应缓冲液

第三章基因的克隆载体

1、载体:在基因工程操作中,携带目的基因、实现目的基因进入受体细胞 ,并在其中得以无性繁殖或表达有意义的

蛋白质所采用的一些 DNA分子。

2、 按功能划分:

克隆载体(cloning vector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体。

表达载体(expression vector):使目的基因能在细菌细胞中表达为 RNA或蛋白质的载体。

3、 基因克隆载体的必备条件 :

多克隆位点;②能自我复制 ,有一个复制起点; ③选择性标记;④安全。

4、 标记基因的作用:①指示外源 DNA分子(载体或重组分子)是否进入宿主细胞;②指示外源 DNA分子是否插

入载体分子形成了重组子。这种指示也可以是选择性的,也可以是非选择性的,绝大多数为后者。

5、 质粒:独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA分子。

6、 质粒的空间构型:①共价闭合环状 DNA (cccDNA);②开环DNA (ocDNA);③线形DNA (IDNA)

7、 质粒空间构型与电泳速率 :scDNA最快、L DNA次之、ocDNA最慢。

8质粒的不亲和性(不相容性):任何两种含有相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在于一个细胞中,这种现 象称为质粒的不亲和性或不相容性,这两种质粒称为不亲和性质粒,组成不亲和性群;而彼此能够共存于一个细胞 中称为亲和性质粒,亲和质粒则属于不同的不亲和群。

9、 天然质粒的局限性:

分子量大,拷贝数低;②筛选标记不理想;③单一酶切位点少或无。

10、 质粒载体的构建策略:

提高质粒载体的拷贝数;②引入多克隆位点 MCS;③引入抗性标记基因;④克隆载体 DNA分子应尽可能小;⑤

在克隆载体中组装“元件”。

10、 筛选重组子的示意图一一重点

11、 互补:

蓝白斑选择原理:① X-gal;② -半乳糖苷酶的显色反应;③ lacZ的 互补。

12、 穿梭质粒载体:人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的 质粒载体。

13、 Ti质粒载体:存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中,诱导冠瘿瘤形成,又称肿瘤诱导质粒。

14、 Ti质粒作为载体的可能性:

能够自发地整合到植物的染色体上;②能转化多种植物;③强启动子一一 T-DNA的opine合成酶基因上游有一个

强启动子,能启动外源基因的表达。

15、 天然Ti质粒作载体的缺点:

分子量太大(200kb);②限制性酶切位点太多。③被转化的植物细胞成为肿瘤,不能再分化。④在大肠杆菌中不 能复制。

16、 Ti质粒的改造:

①保留T-DNA的转移功能部分(vir基因,左右边界)。②减少限制性酶切位点, 引入单一插入位点。

 ③取消T-DNA

的致瘤基因,使被转化的植物细胞不再成为肿瘤,能正常分化。④冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。⑤加入 大肠杆菌的ori和选择标记。⑥加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加 polyA的信号序列。

17、 Ti载体的类型:①共整合载体——需要同源重组才能插入外源基因; ②双元载体一既有大肠杆菌复制起点也有 农杆菌复制起点,是个穿梭载体。

18、 cos位点: DNA两端各有 12bp 的粘性末端,粘性末端形成的双链区域称为 cos位点。

19、 天然 噬菌体作为载体的局限性:

①噬菌体的非必需区太长;②非必需区段上常用的单一限制酶切点少;③选择标记基因少;④载体的安全性

20、 噬菌体载体的构建:

构建策略: ①删除 噬菌体的非必需区,在这个非必需区内制造限制酶切点,删除 DNA必需区段上常用的限制酶

切点;②在非必需区引进选择标记基因。③建立 DNA重组分子体外包装系统

21、 cosmid载体(粘粒):一类由人工构建的含有入噬菌体 DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体,

cos site — carry ing vectors 。

22、 酵母人工染色体:

YAC的特点:(1)只能在酵母细胞中扩增。 (2)克隆容量大,为 230kb-1700kb。(3)构建原理,按染色体结构构

建。

YAC的组成结构:(1)着丝粒区(Ce n); (2)端粒(Tel); (3)复制起点(Ori ); (4)克隆位点;(5 )在酵母中 的标记基因;(6)在细菌中操作;

第四章目的基因的制备

1、 基因组文库:将某种生物整个基因组 DNA切割成大小合适的片段,并将所有这些片段都与话当的载体连接,引 入相应的宿主细胞中保存和无性扩增。理论上讲,这些重组载体上带有了该生物体的全部基因,也称为基因文库。

2、 基因组文库构建的一般步骤 :

①基因组DNA片段的制备;②载体的准备一一相应的酶切,脱磷酸化等处理阻止载体自连

:③载体与基因组 DNA片段的连接一一粘性末端直接连接;人工接头法;同聚物加尾;④转化细胞和克隆选择。

3、 cDNA文库:利用某种牛物的总 mRNA合成cDNA,再将这「些 cDNA与载体连接,转入细菌细胞中进行保存和扩 增,称 cDNA 文库(cDNA library),也称基因文库( gene library)。

4、 cDNA文库的特点:

以mRNA为材料,是 RNA病毒进行基因克隆的唯一途径。

不含内含子序列,可以在细菌中直接表达。

克隆数比DNA文库小的多,容易筛选。

常来自结构基因,包含了所有编码蛋白质的基因,筛选的假阳性率低。

结构基因的表达具有器官、代谢阶段特异性,由不同器官提取的 mRNA所组建的cDNA文库也就不同。

在同一个cDNA文库中,不同类型的 cDNA分子的数目是大不相同的,表现不均匀性。

5、 不对称 PCR( asymmetric PCR)

目的:扩增产生特异长度的单链 DNA。

方法:采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物 ,其最佳比例一般是 50:1或100:1,关键是限

制性引物的绝对量。

6、 差别杂交:需要两种不同的细胞群体 (目的基因正常表达、 目的基因不表达),分别制备两种不同 mRNA提取物,

以两种总mRNA探针平行杂交,对有表达目的基因的总 mRNA反转录构建的 cDNA文库进行筛选。

7、 差别杂交的局限性:

①杂交灵敏度低,对于低丰度的 mRNA尤为明显;②工作量大,需大量的杂交滤膜和鉴定大量的噬菌斑; ③重复性

差,两套平行滤膜之间的 DNA保有量有差别,导致杂交信号不一致。

8消减杂交:

原理:通过 DNA复性动力学原理富集目的基因序列,并以此构建消减文库的方式来分离目的基因。有 mRNA消减

杂交和基因组消减杂交。前者适合分析两样本中差异表达的基因,后者适合克隆两样本特异性存在的基因。

9、 mRNA差异显示 PCR( DD RT-PCR:用3 -端锚定引物和反转录酶合成 cDNA的第一链:用 3 -端锚定引物和 5'-

端 10-mer 随机引物组成引物对,以反转录第一链为模板进行 PCR扩增( mRNA differential display RT-PCR,

DDRT-PCR,在标准的序列胶中电泳 2~3小时,可显示出 50~100条长度在 100~5000 bp之间的 DNA条带。

10、 染色体步移( chromosome walking ): 首先以已知基因或分子标记为探针从基因组文库中筛选与其有共同序歹U

的克隆,再以该克隆为探针从文库中筛选与其有部分重叠序列而且更靠近目的基因的新克隆,同理, 再以新克隆为

探针依次筛选新克隆,直至所需克隆的目的基因。

11、 基因芯片技术(gene chip)特点:

①高度并行性:提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读;②多样性:可进行样品的多方面分析,提高精确

性,减少误差;③微型化:减少试剂用量和反应液体积,提高样品浓度和反应速率;④自动化:降低成本,保证质 量。

第五章目的基因导入受体细胞

1、 DNA体外连接应注意的事项:

插入片段与载体的酶切位点互补

DNA插入的方向正确

插入基因的开放阅读框(ORF正确 (1) DNA定位插入载体 (2)起始密码

防止载体自身环化连接 (1)提高插入片段的用量 (2)用碱性磷酸酶处理载体

2、 大肠杆菌受体细胞的选择

重组缺陷型:避免与受体基因组进行同源重组,便于重组 DNA独立存在

限制缺陷型:避免修饰和降解,使重组 DNA稳定存在易于转化或转导:提高细胞的通透性,较高的转化率

遗传互补型:有明显的选择性差异 ,有利于重组体筛选具有较好的翻译后加工,有利于真核基因表达

感染缺陷型:防止感染,安全性高,无致病基因

3、 感受态大肠杆菌的制备

制备原理:当细菌处于0C、二价阳离子(如 Ca2+、M『等)低渗溶液中时,细菌细胞膨胀成球形,处于感受态; 此时转化混合物中的 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,重组 DNA在 42C短时间热冲击后吸

附在细胞表面而利于进入,在丰富培养基中生长数小时后,球状细胞恢复原状并繁殖。

4、 外源DNA导入细菌的几种方法

(1)转化 (2)转染(3)转导

5、 重组质粒导入受体的转化方法

(1)热激法或热休克转化法 (2)电转化法 (3)平板培养细菌

6、 重组DNA导入真核细胞

(1) 酵母细胞 ①利用原生质体进行转化 ②利用Li +盐进行转化

(2) 植物细胞 ①农杆菌介导法 ②电击法 ③基因枪法

(3) 哺乳动物细胞 ①磷酸钙沉淀法 ②脂质体(lipofectin )载体法 ③显微注射法 ③DEAE---葡聚糖转染法

7、 重组体克隆的筛选和鉴定

①遗传表型直接筛选法 ②DNA电泳检测法 ③核酸杂交检测法 ④免疫化学检测法

转译筛选法 ⑥真核生物常用的重组基因选择方法 ⑦DNA序列测定

8根据载体的抗药性标记进行筛选

PBR322抗菌素标记选择 (图已省---打出来黑的)

四环素抗性基因

氨苄青霉素抗性基因

-半乳糖苷酶显色反应选择法

9、核酸杂交检测法

Souther n hybridizatio n 原理

根据毛细血管作用的原理,使在凝胶电泳中分离的 DNA片段转移并结合到适当的滤膜上,然后通过同已标记的单链

DNA或 RNA探针进行杂交,以检测被转移 DNA片段,成为DNA印迹杂交技术。也称 Southern杂交

Norther n hybridization 原理

指根据毛细管作用的原理, 使在凝胶电泳中已分离的 RNA转移并结合到适当的滤膜上, 然后通过同已标记的单链 DNA 或RNA探针进行杂交,以检测被转移 RNA片段,称为 RNA印迹杂交技术,也称为 Northern杂交(Northern blot )

Dot blot hybridizati on 原理

在杂交的基础上发展起来的用于快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸样品直接转移到适当的滤膜上,然后进

行杂交检测。

Colony and plaque hybridizati on 原理

将菌落或噬菌斑直接转移到滤膜上,使溶菌班变性的 DNA同滤膜原位结合,然后进行杂交测验。

杂交后根据杂交信号及其相对应的菌落或噬菌斑的位置,便可从大量菌落或噬菌斑中筛选出含有目标基因序列(与

探针同源)的菌落或噬菌斑。所以,有时也称菌落(噬菌斑)原位杂交。

11、 酶联免疫吸附测定(ELISA) 原理:

一抗(primary antibody ):与目标分子的特异结合。

二抗(secondary antibody ): 与一抗的特异性结合。

酶联(enzyme-link ):二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质(或发光) ,再通过比色

测定有色物质的含量(或光强度),从而推测目标分子的含量。

12、 一般克隆与筛选策略

13、 HAT法原理

选择培养基中有次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷 ,培养基中的氨基喋啉阻断细胞核苷酸的全程合成,但启动以次黄嘌呤 为底物进行核苷酸的补救合成途径, 不受氨基喋啉的抑制,另外培养基中的胸苷可通过胸苷激酶的作用合成核苷酸, tk +能合成核苷酸,而tk「不能合成而死亡。

14、 二氢叶酸还原酶基因(DHFR (看图背原理)

(1) 选择原理

(1) 选择原理

①二氢叶酸还原酶的必要性 :真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸

dhfR胞能产生二氢叶酸还原酶,所以能合成四氢叶酸。 能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤 的培养基中生存 ,不需要

补救!

不能在无胸苷和次黄嘌呤的培养基中生存。当加入 需要补救!DHFR细胞不能产生二氢叶酸还原酶,所以不能合成四氢叶酸。

 胸苷和次黄嘌呤, DHFR-细胞可通过补救合成途径维持生长。

不能在无胸苷和次黄嘌呤的培养基中生存。当加入 需要补救!

胸苷和次黄嘌呤补救

无四氢叶酸提供甲基,dNTP合成受阻时,

胸苷和次黄嘌呤分别补救:

选择过程

宿主细胞 DHFF细胞株(不能在无核苷酸的培养基中生长) 。需要胸苷和次黄嘌呤补救!

无核苷酸的培养基 透析除去血清中的内源性核苷酸,以免补救。

氨甲喋啉“加压” 添加少量氨甲喋啉抑制内源性 DHFR勺补救作用,可提高选择。

载体标记 DHFf基因。只有转入 DHFf基因的细胞才能生存。

15、 报告基因:是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。

16、 几种常用的报告基因

大肠杆菌的 3 -D-葡萄糖醛酸糖苷酶 (B -D-glucuronidase , GU$;

细菌和萤火虫的荧光素酶 (luciferase , luc);

水母绿色荧光蛋白( GFP 基因 (Green Fluoresce nt Protein )。

17、 DNA序列测定的方法

化学降解法测序

原理:一个末端标记的 DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得到部分降解,其中每一组反应特异的针对某一

种或某一类碱基。造成碱基的特异性切割,由此产生的一系列具有不同长度的 DNA寡聚核苷酸链,经凝胶电泳分离

和检测,读出核苷酸序列。

双脱氧链终止法测序

原理:(1) DNA聚合酶在模板指导下,聚合酶不断将 dNTP加到引物的3' -OH末端,能利用单链的 DNA作为模板合

成出准确的DNA互补链;

(2)如果加入双脱氧三磷酸核苷 (ddNTP),由于双脱氧核糖的 3'位置上缺少一个羟基, 故不能同后续的dNTP形成

磷酸二酯键,从而终止DNA链的延长。即形成一种全部具有相同 5'-引物端和以ddNMF残基为3'端结尾的一系列

长短不一片段的混合物。聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链 DNA从而读取DNA的核苷酸序列。

18、 双脱氧终止法测序反应体系包括 :

DNA聚合酶

单链DNA模板

引物,通常由20-23个碱基构成,G+C=12 A+T=8到11, Tm=60-68C,避免形成引物二聚体或形成发卡样结构

Mg2+

4 种 dNTP(dATP,dGTP,dCTF和 dTTP)

4 种 ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和 ddTTP)

第六章外源基因的表达

1、 外源基因的表达系统:基因工程的主要目的之一,就是要制备大量有用的蛋白质和多肽,尤其是人体蛋白。得 到了克隆的基因或 CDNA后,按照正确的方向插入表达载体,连在启动子的后面,导入相应的宿主细胞,即可进行 表达。在不同的表达系统中,其表达方式不尽相同。

2、 外源基因的有效表达关键:起始转录。

3、 mRNA的延伸与稳定性:

外源基因的有效表达的关键:保持 mRNA的有效延伸、终止及稳定存在。

构建载体需考虑因素:

①避免非特异性终止,加入抗终止序列;②加入正常转录终止序列,减少 DNA反向转录为反义 mRNA的机会;

选择受体菌 Rnase缺失(原核);④加入poly(A)的信号序列AAUAAA有利于mRNA的正确加工(真核)。

4、 表达蛋白在细胞中的稳定性

几个方面考虑: ①融合蛋白,外源蛋白与受体蛋白有良好的杂合构像; ②分泌蛋白, 外源蛋白能分泌到细胞周质

腔或直接分泌到培养基; ③包涵体,外源蛋白以包涵体的形式存在与于受体细胞;④选择蛋白水解酶基因缺陷型的 受体系统

5、 融合蛋白的优点:

①融合蛋白较稳定,不易被细菌蛋白酶水解。②可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析,便于纯化。③原核蛋白 部分可用蛋白酶切掉,释放出天然的真核蛋白质。④目的蛋白溶解性好,融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构 象,且大多具有水溶性。

6、 分泌蛋白的优点:

①目的蛋白稳定性高;②目的蛋白易于分离;③目的蛋白末端完整。

7、 包涵体形式的优点:

①能简化外源基因表达产物的分离操作;②能在一定程度上保持表达产物的结构稳定

8、 启动子:能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的DNA序列。

9、 启动子的分离:①随机克隆法;②聚合酶保护法;③过滤膜结合法;④ PCR扩增法

10、 随机克隆法:

①选用适当的核酸内切酶消化切割的染色体 DNA分子;②接着将切割产生的 DNA限制片段与一种无启动子的质粒

载体重组,使克隆的片段恰好插入在紧邻报告基因( galK)的上游位置;③随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄

主细胞,构成质粒载体基因文库,并检测报告基因的表达活性。

11、 增强子:远离转录起始点数千个碱基的能增强启动子转录活性的 DNA顺式作用元件,对转录有增强作用,约 为100?200bp,有单拷贝或多拷贝。

特征:

①双向性;②重复序列;③无位置特定性;④特异性(组织) ;⑤功能不受基因来源影响

12、 终止子: 转录启动后, RNA酶沿 DNA链移动,持续合成 RNA链,直到遇到转录终止信号。

13、 原核表达系统的注意事项:

①外源基因不能带有内含子。②必须用 CDNA,不能直接用真核基因组 DNA。③必须利用原核细胞的调控原件(启

动子等)。④防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。

14、 外源蛋白在大肠杆菌中的表达:

细胞质中表达:

优点:易于分离;免受蛋白酶降解;蛋白质没有活性,不损害寄主细胞

缺点:蛋白质的终产量偏低,蛋白质种类多,纯化复杂;蛋白质的生产成本比较昂贵 ;空间结构错误,一般无生物

学活性;蛋白质修饰的环境不利于二硫键的形成。

周质中表达:

优缺点:周质中蛋白质种类比较少,目标蛋白质的 纯化就比较简单;蛋白质酶解的程度不甚严重 ;促进了二硫键

的形成及蛋白质的折叠作用(氧化环境) ;蛋白质的N—末端结构真实;信号肽并非总是有助于蛋白质的转运 ;有

可能形成包涵体。

胞外表达:

优缺点:蛋白质的酶解作用程度低;分泌到胞外的蛋白质种类少,目标蛋白容易纯化 ;蛋白质N-末端的结构真实,

增进了蛋白质的折叠作用;外源真核蛋白质,通常是不会分泌到胞外培养基中去的 ;分泌在胞外培养基中的蛋白质

相当稀释,目标蛋白质的纯化过程复杂。

15、 高效表达目的基因的策略 :

①优化表达载体的设计;② 增加mRNA的拷贝数和稳定性;③提高表达产物的稳定性; ④优化发酵过程。

16、 酵母表达系统优点:

①表达调控机制较清楚;②有翻译后的加工修饰系统 ;③可分泌外源蛋白到培养基中,易纯化;④酵母不含毒素,

安全性高;⑤大规模发酵工艺简单,成本低。

17、 酵母表达系统缺点:

①表达量普遍低;②常发生质粒丢失;③重组蛋白常常超糖基化;④分泌困难。

18、 表达载体组成:

①启动子;②终止子;③ T-DNA;④选择标记基因与报告基因。

19、 选择标记基因:能在转化体中有效表达并易于检测或定量分析。

20、 报告基因:报告和识别作用,它的表达产物对植物细胞无毒性,可反映外源基因在植物细胞中的转译水平。

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